Cromatografía

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Bases de la Cromatografía Líquida

Definición y clasificación primaria de cromatografía

Seg√ļn IUPAC (1-4), podemos definir el proceso como "un m√©todo f√≠sico de separaci√≥n en el cual los componentes de la muestra a ser separados son distribuidos en dos fases, una de las cuales permanece inm√≥vil (fase estacionaria) mientras la otra (la fase m√≥vil) se mueve en una direcci√≥n definida.

La Fase Estacionaria es una de las dos fases que componen el sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si fuera un líquido, puede estar distribuido sobre un sólido...

La Fase Móvil es un fluido que percola a través o a lo largo de un lecho estacionario en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía líquida) o un gas (cromatografía gaseosa)".

Seg√ļn IUPAC, la cromatograf√≠a puede clasificarse de varias formas, seg√ļn el m√©todo, forma del lecho estacionario, de la naturaleza f√≠sica de la fase m√≥vil y de acuerdo con el modo de separaci√≥n (ver figura 1.1.).

cromatografia

Figura 1.1.Clasificaci√≥n de cromatograf√≠a seg√ļn el m√©todo, forma f√≠sica del lecho estacionario y estado f√≠sico de la fase m√≥vil seg√ļn IUPAC(1).

En relaci√≥n con la cromatograf√≠a liquida (LC) en columna, podemos encontrar LC con part√≠culas grandes operadas por gravedad o a baja presi√≥n, conocida como cromatograf√≠a liquida en columna, y LC con micropart√≠culas que hacen necesario el uso de bombas para la eluci√≥n de la fase m√≥vil. Si las micropart√≠culas son mayores de 2 őľm es posible utilizar un sistema de HPLC, pero si tienen menos de 2 őľm es necesario utilizar un sistema de UPLC o UHPLC.

La clasificaci√≥n seg√ļn el mecanismo de separaci√≥n es algo m√°s extensa y compleja, incluyendo las siguientes(1).

Denominación del MétodoMecanismo de separación
Cromatografía de AdsorciónDiferencia de afinidad de adsorción entre componentes de la muestra y los
sitios activos de la fase estacionaria
Cromatografia de AfinidadEspecificidad biológica de la interacción analito-ligando
Cromatografía en Contraco-
rriente(CCC)
Partición entre dos fases liquidas inmiscibles sin soporte sólido
Cromatografía Quiral o Enan-
tioselectiva
Separación por interacción con un se lector quiral del sistema, tipicamente la fase estacionaria pero también puede estar en la fase móvil
Cromatografia de Exclusión por
tama√Īo(SEC)
Separaci√≥n por exclusi√≥n (tama√Īo y/o forma del analito) con curvas de calibraci√≥n basadas en el peso molecular. Seg√ļn la fase m√≥vil puede ser GFC(acuosas) o GPC(org√°nicas)
Cromatografía HidrodinámicaSeparación de macromoléculas por diferencia de velocidad de fase móvil entre
el eje y las paredes de la columna
Cromatografía de Interacción
Hidrofílica-HILIC
Partición/Intercambio iónico en columna de fase normal, emplea una fase móvil
org√°nica con peque√Īa proporci√≥n de agua
Cromatografía de Interacción
Hidrofóbica-HIC
Separación por interacción entre sitios hidrofóbicos de la fase estacionaria y sectores hidrofóbicos de las proteínas que se exponen por efecto de la fuerza iónica
Cromatografía de Intercambio
Iónico
Separación por intercambio iónico entre grupos funcionales de la columna y componentes de la muestra. El intercambio puede ser de aniones o de cationes
Cromatografía de Exclusión
Iónica
Exclusión de la partícula y elución tem prana de componentes iónicos, mientras
compuestos de carga opuesta se retienen y eluyen después
Cromatografía de Apareamiento IónicoPartición de pares iónicos formados entre el analito iónico y un aditivo de carga
opuesta, en un buffer apropiado
Cromatografía de Intercambio
de Ligandos
Separación basada en la capacidad del analito de formar complejos con metales
Cromatografía MicelarCromatografía en fase reversa donde la fase móvil contiene un surfactante en concentración superior a la micelar critica
Cromatografía en Fase NormalSeparación donde la fase estacionaria es más polar que la fase móvil
Cromatografia de ParticiónSeparación basada en la diferencia de solubilidad de los componentes de la
muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria
Cromatografía en Fase ReversaSeparación de LC donde la fase móvil es más polar que la fase estacionaria

HPLC - UPLC - UHPLC

HPLC proviene de las siglas en ingl√©s de High Performance Liquid Chromatography, que ser√° aqu√≠ traducido como Cromatograf√≠a L√≠quida de Alta Performance y manteniendo aquel acr√≥nimo. Se prefiere esta denominaci√≥n a otras utilizadas en otros medios como CLAP (castellanizaci√≥n de las siglas en ingl√©s), de alto desempe√Īo o de alta eficacia, tambi√©n utilizado por otras fuentes. Tampoco se traducir√° como Cromatograf√≠a Liquida de Alta Presi√≥n como reflejo de las siglas utilizadas por primera vez por Csaba Horvath, pionero de esta ciencia, por el simple motivo que la presi√≥n no es una herramienta de separaci√≥n sino la consecuencia natural de forzar el pasaje de un l√≠quido a trav√©s de una columna rellena con macropart√≠culas. Un hecho m√°s claro pero que ha llevado a ciertos malentendidos es la llegada de UHPLC. Dado que los sistemas de HPLC "convencionales" hab√≠an llegado a dispensar presiones de hasta 6000 psi, ese nivel de presi√≥n se convirti√≥ en un est√°ndar de la industria. Sin embargo, la evoluci√≥n de la part√≠cula cromatograf√≠a a di√°metros menores de 2 őľm hizo necesario superar esa barrera. El primero en hacerlo fue Waters Corp., quien llam√≥ al sistema UPLC¬ģ por "cromatograf√≠a liquida de ultra performance" y registr√≥ el nombre y las siglas, evitando el uso de este acr√≥nimo por otras empresas de instrumental.

Estos sistemas pueden hoy llegar a presiones de hasta 1500 atm o casi 22000 psi, y es claro que el objetivo de su creaci√≥n fue simplemente utilizar la part√≠cula sub-2 creada, para lo cual era necesario aumentar la presi√≥n m√°xima de trabajo y disminuir tanto como fuera posible el volumen muerto del sistema, reducir el volumen de celda y aumentar la velocidad de respuesta del detector, factores imprescindibles para no perder la eficiencia ganada con la reducci√≥n del tama√Īo de part√≠cula.

Al conseguir trabajar a mayor presión, con partículas de menor diámetro y por tanto más eficientes, parece haberse interpretado que esta moda-lidad era mejor, y por tanto diferente a HPLC y digno de otro nombre. Ante la novedad, la competencia en desventaja comercial en principio se opuso a esa modalidad argumentando falta de mérito y riesgos físicos para trabajar a presiones tan altas, reforzando la idea de que se trataba de otro sistema. Sin embargo y con la difusión creciente de la modalidad, y ante la mayor velocidad de trabajo, mayor eficiencia y menor consumo de solvente, finalmente comenzó el desarrollo y producción general de estos instrumentos, que se llamaron UHPLC para evitar el uso de un nombre ya registrado.

Sin embargo, se hab√≠a producido una mella en la confianza de algunos usuarios, la sensaci√≥n de que realmente pod√≠a ser otro m√©todo, y la consecuencia fue la imposibilidad, en √°mbitos regulados, por ejemplo, USP, EP, JP, de transferir procedimientos desarrollados y validados en HPLC a UHPLC, simplemente porque se "tratar√≠a" de otro modo de separaci√≥n. Sin embargo, las columnas, rellenos y funcionalidad de los rellenos es la misma, la fase m√≥vil es la misma, los mecanismos de separaci√≥n, la interpretaci√≥n de los cromatogramas y los c√°lculos son los mismos. Fue necesario esperar la maduraci√≥n del sistema para que fuera aceptado, y que se comprobara experimentalmente la equivalen cia, para que fuera posible la transferencia de procedimientos, lo cual se tradujo en el primer documento armonizado del cap√≠tulo de cromato-graf√≠a de la USP (5), EP y JP en 2017, donde se propuso la transferencia de m√©todos de HPLC a UHPLC y viceversa en entornos regulados. Esto no quita por supuesto, que los m√©todos oficiales deben ser verificados antes de su implementaci√≥n seg√ļn prescriben la USP (6), FDA (7),ISO(8) y AOAC (9), ya sea que hayan sido transferidos a UHPLC o no. El concepto m√°s importante es la conclusi√≥n de que ambas modalidades son equivalentes, y que los procedimientos oficiales pueden ser escalados, verificados y utilizados tal como fueron validados originalmente, sin p√©rdida del estatus "oficial".

El mecanismo de la separación

Volviendo a la definición de IUPAC, “Cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes de la muestra a ser separa-dos son distribuidos en dos fases...".

De modo que debemos evaluar un sistema de tres componentes, la muestra, la fase estacionaria y la fase móvil. En la figura 1.2, la muestra tiene tres componentes, cada uno de los cuales tiene una estructura química diferente, caracterizada por la presencia de grupos funcionales que la identifican, por ejemplo, grupos hidroxilo fenólico o alcohólico, aminos primarios o secundarios, aldehídos, cetonas, etc. A su vez, la fase móvil y la fase estacionaria tienen sus propios grupos funcionales, que le otorgan afinidad por grupos funcionales complementarios (ver figura 1.1).

cromatografia

Figura 1.2. Componentes de la muestra y su interacción con el sistema, fase móvil y fase estacionaria. La funcionalidad química de cada componente determina su afinidad por los estos componentes, y de ese modo, su mayor o menor retención en la columna. Se esquema-tizan tres tipos de moléculas, un hidrocarburo lineal, una molécula dipolar y un fenol como molécula polar.

Existen diversas interacciones que modelan la afinidad entre molécu-las. Una de las más importantes es el puente de hidrogeno, donde un átomo de hidrogeno está unido covalentemente a un átomo electronegativo en una molécula donante de protones que lo expone. En el entorno puede encontrar una molécula aceptora de protones con otro átomo electronegativo, ávida por ese protón a quien atrae, pero no puede tomarlo por estar unido covalentemente a primera molécula. Esta interacción está muy difundida en la naturaleza, por ejemplo, entre grupos carbonilos y aminos de las proteínas para formar su estructura tridimensional, entre bases complementarias del DNA, entre el agua y el hidroxilo de un alcohol, o un carbonilo, etc.

Otras interacciones incluyen las electrost√°ticas entre aniones y cationes, las interacciones hidrof√≥bicas e hidrof√≠licas que hacen que no se mezcle aceite y agua que se agrupan entre s√≠, las interacciones est√©ricas que dificultan el ingreso de una mol√©cula en la fase ligada por impedimento est√©rico, debido simplemente al tama√Īo del analito, las fuerzas de London, d√©biles y producidas por los dipolos temporarios que se crean en cada √°tomo por movimiento de sus electrones, las interacciones dipolares producidas por mol√©culas de polaridad permanente como el acetonitrilo entre otras fuerzas de retenci√≥n (figura 1.3).

En la separación cromatográfica (figura 1.4), la fase estacionaria contenida en una columna es equilibrada con un caudal constante defase móvil. La salida de la columna se conecta a un dispositivo de monitoreo que mide alguna propiedad fisicoquímica del líquido que eluye, en el caso de la figura un detector fotométrico o espectrofotométrico, pero puede ser de conductividad, fluorescencia, amperométricos, etc.

Una vez equilibrado el sistema se inyecta la muestra constituida por una soluci√≥n que contiene varios componentes, los cuales viajan a trav√©s de la columna transportados por la fase m√≥vil. De acuerdo con la funcionalidad qu√≠mica, cada uno de los componentes mostrar√° mayor afinidad por la fase m√≥vil y eluir√° m√°s r√°pidamente, o mayor afinidad por la fase estacionaria y se retendr√° seg√ļn esa interacci√≥n.

Como resultado,los componentes viajar√°n a trav√©s de la columna con diferente velocidad y ser√°n separados. La fase m√≥vil elu√≠da pasa a trav√©s de una celda de flujo donde es monitoreada porel sistema apropiado, en este caso un haz de luz que atraviesa la celda de flujo para encontrar una fotoc√©lula, sensible al cambio de transmisi√≥n/absorci√≥n de la luz. La fase m√≥vil contin√ļa su camino y la se√Īal de la fotoc√©lula, proporcional a la absorci√≥n instant√°nea del eluido que atraviesa la celda, se transmite a un registrador grafico o a un sistema de registro y procesamiento de datos en una computadora. El resultado es un cromatograma, representaci√≥n de la se√Īal generada por la fotoc√©lula en funci√≥n del tiempo (ver figuras 1.7 a y b).

El cromatograma muestra entonces la separaci√≥n de los componentes de la soluci√≥n inyectada en un gr√°fico de la se√Īal adquirida por el detector (mV) en funci√≥n del tiempo (minutos). El tiempo de retenci√≥n (tomado como el tiempo de eluci√≥n de v√©rtice del pico), es consecuencia de la estructura qu√≠mica y funcionalidad, y es por tanto funci√≥n primaria de la identidad del componente. El tiempo de retenci√≥n de A identifica primariamente al compuesto A como componente de la soluci√≥n inyectada, al igual que B y C. Por su parte, la intensidad de la se√Īal, medida como altura de pico o de √°rea bajo la curva es funci√≥n primaria de la concentraci√≥n.

cromatografia

Figura 1.3. Algunos ejemplos de interacción entre el analito, la fase móvil y la fase estacio-naria: dipolos transitorios de London, interacción por dipolos permanentes, efectos estéricos, interacción hidrofóbica e hidrofílica y puente de hidrógeno.
cromatografia

Figura 1.4. Representaci√≥n esquem√°tica de la separaci√≥n cromatogr√°fica y su resultado, el cromatograma. Los compuestos separados en la columna son monitoreados a su salida por medio de un detector, en este caso fotom√©trico que registra la se√Īal, en este caso absorci√≥n, en funci√≥n del tiempo. El volumen de eluci√≥n/tiempo de retenci√≥n es funci√≥n primaria de la identidad del analito, ya que depende de su funcionalidad qu√≠mica. La intensidad de la se√Īal representada por altura de pico o √°rea bajo la curva son funci√≥n de la concentraci√≥n de cada analito eluido de la columna.

Dado que no es posible conocer a priori el tiempo de retenci√≥n ni la respuesta del soluto, es necesario contar con un est√°ndar de referencia apropiado del material. Para ello se inyecta una soluci√≥n de concen-traci√≥n conocida delIest√°ndar, y se calibra el sistema para adjudicar la identidad del componente en base a su tiempo de retenci√≥n, y se calcula un factor de respuesta que relaciona la intensidad de la se√Īal con la concentraci√≥n del est√°ndar. Luego al inyectar la muestra, el componente buscado (id√©ntico al est√°ndar) se identifica por el tiempo de retenci√≥n y su concentraci√≥n por el factor de respuesta estimado para el est√°ndar.

Aqu√≠ debe mencionarse el principio der incertidumbre relacionado con la identidad. Si bien es claro que la identidad de los componentes A, B y C es funci√≥n del tiempo de retenci√≥n, es tambi√©n claro que en la naturaleza seguramente existen decenas o cientos de compuestos que eluir√°n con un tiempo de retenci√≥n similar o indiferenciable del tiempo de retenci√≥n del componente buscado. Para el caso de la figura, pueden existir cientos de compuestos que eluyen en 10 minutos de corrida. Entonces, la validez de la primera aseveraci√≥n, identidad, ser√° m√°s confiable en los √°mbitos donde la variabilidad de componentes no sea muy alta, por ejemplo, en una industria que maneja unas pocas decenas de materiales para producir unos pocos productos. A medida que la diversidad se expande, va siendo necesario contar con herramientas de confirmaci√≥n de identidad, por ejemplo, por an√°lisis estructural (an√°lisis espectrosc√≥pico simult√°neo, an√°lisis de pureza de pico, peso molecular) para mantener control sobre la validez del resultado. Y habr√° casos en los que la diversidad es absolutamente compleja, como en el caso de pruebas bioanal√≠ticas donde las matrices biol√≥gicas aportan un n√ļmero muy elevado de interferentes potenciales, o en un screening medioambiental, o en el an√°lisis de alguna estructura en matrices naturalmente complejas como frutas o extractos vegetales. En estos casos puede ser absolutamente necesario contar con detectores muy selectivos, como acoplamientos masa-masa o de tiempo de vuelo.

En relación con la incertidumbre relacionada con la concentración, es claro que debe buscarse una correlación entre la respuesta y la concentración del estándar en el sistema usado, y que la respuesta del analito debe interpolarse en esa curva de calibración, en un sistema calificado, usando un procedimiento validado.

El Sistema Cromatrogr√°fico

La figura 1.5 muestra esquem√°ticamente la versi√≥n m√°s simple de un sistema de HPLC. Es necesario contar con al menos un reservorio de fase m√≥vil, una bomba, inyector, columna y detector, con los tubos y uniones correspondientes. El detector debe conectarse m√≠nimamente a un registrador gr√°fico XY, aunque el an√°lisis moderno estimula el uso de una computadora que act√ļa como sistema de adquisici√≥n, almacenamiento y procesamiento de datos.

sistema cromatografico

Esquema b√°sico de un cromat√≥grafo. Los componentes m√≠nimos imprescindibles son el reservorio de fase m√≥vil, la bomba, el inyector, la columna, el detector y un recipiente de desechos, todos estos unidos por tuber√≠as de di√°metro interno apropiado. La se√Īal el√©ctrica en funci√≥n del tiempo es tomada por un dispositivo que var√≠a desde un registrador grafico hasta una computadora, y en el √ļltimo caso, la posibilidad agregada de almacenar la se√Īal para reprocesamiento o control regulatorio.

Si bien ese esquema b√°sico puede ser suficiente para gran n√ļmero de aplicaciones, es inevitable su expansi√≥n hacia sistemas m√°s complejos por necesidad de optimizaci√≥n y automatizaci√≥n (ver figura 1.6). As√≠, por ejemplo, la confiabilidad del an√°lisis instrumental recae en gran medida en el an√°lisis estad√≠stico, que promueve el procesamiento de replicados para calcular la incertidumbre.Esto lleva a la conveniencia de inyectores autom√°ticos, que por otra parte permiten la optimizaci√≥n de tiempo y recursos.

Luego, en ocasiones es necesario utilizar gradientes de eluci√≥n, lo que permite el uso de m√ļltiples solventes para preparar in situ la fase m√≥vil, los cuales pasan por desgasificadores on-line antes de llegar a la bomba. El gradiente puede formarse utilizando una o dos bombas.

Luego, es posible y en ocasiones conveniente usar un horno de columna para alojar una o más de una columna cromatográfica. El sistema puede programarse para usar la primera, lavarla, acondicionar la segunda y luego usarla y lavarla y apagar el sistema al terminar, todo sin necesidad de la operación del analista. La diversidad de analitos puede hacer necesario el uso de más de un detector, y el eluido de la columna no necesariamente debe descartarse, sino que los componentes separados pueden ser recolectados por sistemas apropiados.

cromatografo

El esquema básico de la figura 1.5 sumará complejidad en trabajos de desarrollo y de rutina, básicamente para mejor aprovechamiento de la automatización. Es frecuente dejar que el sistema prepare la fase móvil en lugar de hacerlo en mesada. Eso demanda el uso simultáneo de más de un solvente, que también puede ser desgasificado in situ. Tampoco es infrecuente utilizar más de una columna, o más de un detector. O separar las fracciones en modo preparativo en lugar de descartar las fracciones separadas. Y lavar las columnas antes de cambiar a la siguiente, todo en forma automática.
CromatogramaPrueba de aptitud del sistema
MaterialSolución estándar 1019Origen: Laboratorio QA
AnalistaFQ-SRVial: 1
Fecha26/07/2022Hora: 12:19:46
Figura 1.7 a. Reporte cromatográfico típico mostrando una tabla relacionada con la muestra inyectada. El cromatograma típico muestra la información relacionada con la muestra procesada (origen, analista, fecha, hora, vial, etc.), el cromatograma con las bandas y su identificación y finalmente una tabla con el listado de picos en orden de aparición, su identidad en función de un estándar de calibración previo, y para cada pico su tiempo de retención, área bajo la curva, altura y algunos datos informativos de calidad(eficiencia, asimetría y resolución).
reporte cromatografico
Figura 1.7 b. Visualizaci√≥n t√≠pica del cromatograma en el software de procesamiento,en este caso Empower ¬ģ Waters Corp., donde se visualizan los gr√°ficos de: arriba izquierda, isograma (proyecci√≥n 2D del grafico 3D: tiempo vs respuesta vs longitud de onda -ver cap√≠tulo 3- en un PDA o DAD), abajo izquierda el cromatograma a la longitud de onda indicada en el isograma (246 nm), y a la derecha, los espectros de absorci√≥n UV de los picos identificados. Estos es-pectros pueden llevarse a la biblioteca y ser usados para la identificaci√≥n de picos.
Breve rese√Īa hist√≥rica de la Cromatograf√≠a L√≠quida

Lo que sigue son pinceladas del desarrollo histórico de la cromatografía líquida y HPLC que fueron tomadas de artículos publicados por renombrados investigadores de la cromatografía. No pretende ser una descripción exhaustiva o completa del desarrollo de la cromatografía y seguramente es injusta con muchos investigadores cuya contribución fue fundamental para esta técnica esencial en prácticamente todas las ciencias modernas, pero su lectura puede ayudar a comprender los mecanismos, y tal vez a mejorar los procesos actuales. Muchos de los acontecimientos citados pueden mostrar brevemente el origen y algunos hitos que nos permitieron llegar aquí(11-17).

El inicio no puede excluir la invenci√≥n de la cromatograf√≠a, que debemos a Mikhail Semyonovich Tsweet quien la desarroll√≥ en 1900. Tsweet naci√≥ en 1872 en Asti, Italia, hijo de madre italiana y de un oficial ruso. Muy joven se mud√≥ a Suiza donde se gradu√≥ y se dedic√≥ a la bot√°nica. Luego sigui√≥ a su padre cuando √©ste fue llamado nuevamente a Rusia y se radico en San Petersburgo. Debi√≥ revalidar sus t√≠tulos en Mosc√ļ, donde ejerci√≥ actividades acad√©micas, as√≠ como en Varsovia y en Lituania. Us√≥ por primera vez el nombre de Cromatograf√≠a en sus publicaciones de 1906 (ver figura 1.8). En suus trabajos llenaba tubos de vidrio con un s√≥lido, en el caso de la figura con carbonato de calcio y lo equilibraba con un l√≠quido, disulfuro de carbono. Luego de introducir clorofilas en soluci√≥n en el extremo superior, elu√≠a el l√≠quido a trav√©s de la columna con lo cual los pigmentos se separaban en la columna y dejaban ver una secuencia de bandas coloreadas. En ese momento cre√≥ el nombre de cromatografia, del griego chroma (color) y grapho (escritura), o sea, escritura en color.

historia de la cromatografia
sistema hplc antiguo
columna cromatografica

Figura 1.8. Dibujos del artículo publicado en 1906 por Tsweet. Incluye en (a) un aparato con cinco columnas simultaneas con manómetro de mercurio y una pera de goma para dispensar la fase móvil. También muestra en (b) una columna tipo embudo de 2-3 mm de diámetro y 20-30 cm de longitud montada sobre un Kitasato y en (c) una separación cromatográfica de pigmentos, utilizando carbonato de carbono como fase estacionaria y disulfuro de carbono como fase móvil.Reproducido con autorización de LC-GC.

En realidad, no se hacía eluir de la columna a los componentes de la muestra tal como hacemos actualmente, sino que constituían dentro de ésta un patrón de colores que representaba la composición de las clorofilas. El método tuvo gran repercusión,pero naturalmente tenía grandes limitaciones al no poder visualizar componentes incoloros, y al no permitir la elución de los componentes de la columna.

La cromatograf√≠a en capa delgada (TLC) present√≥ una soluci√≥n a este problema.La TLC pod√≠a considerarse como una cromatograf√≠a en columna abierta, de modo que, al acceder al material, pod√≠an efectuarse revelados espec√≠ficos o universales seg√ļn fuera necesario. Por ejemplo, la aplicaci√≥n de un aerosol de ninhidrina seguido de calor revela los amino√°cidos,incoloros, que toman color azul. Los vapores de iodo,al exponer la placa seca luego de la corrida a sus vapores, se fijan sobre los compuestos org√°nicos con dobles o triples enlaces confiri√©ndoles color marr√≥n rojizo. Y la simple aspersi√≥n de √°cido sulf√ļrico seguida por calentamiento en estufa a 100¬į‚ĄÉ carboniza los compuestos org√°nicos que se visualizan como manchas oscuras sobre la placa blanca.

HPTLC de aceite de chamomile, distintos revelados

UV 254 nm con y sin filtro

UV 366 nm Post derivatización

Derivatización anisaldenido Reflactancia R+T Transm.


Figura 1.9.Cromatografía en placa delgada de aceite de chamomile mostrando el resultado del empleo de diversos reveladores para la visualización de los compuestos separados.

Uno de los primeros precursores de esta técnica fue Edgar Lederer y tuvo avances más recientes con Egon Stahl. El impacto de la TLC fue inmediato, y debido a su simplicidad y bajo costo gano rápidamente terreno en el campo de la química analítica. En el momento de la mayor difusión de la cromatografía liquida y gaseosa, la TLC siguió desarrollándose en Europa del este. Hoy se sigue utilizando, aunque con mucho menor difusión por el avance de HPLC.

Poco después, la cromatografía liquida (LC) tuvo un avance muy significativo en la década del '40 cuando Archer J.P. Martin y Richard L.M. Synge crearon la cromatografía de partición o cromatografía liquido-liquido (LLC), opuesta a la cromatografía líquido sólido (LSC) que predominaba en ese momento, y tal fue el impacto de ese desarrollo que por el recibieron el premio nobel de química de 1952.

Martin investigaba la vitamina E en Dunn Nutritional Laboratory, y estaba experimentando con la separación de carotenos fases heterogéneas. Había construido para ello un sistema de 45 tubos encadenados que servían como ampollas de decantación, separados por 90 válvulas que impedían el retorno del líquido a la ampolla anterior. El esquema de su aparato no fue publicado.

Synge por su parte investigaba los amino√°cidos de la lana en IWS, y el m√©todo empleado consist√≠a en acetilar los amino√°cidos para extraerlos en cloroformo. Comprob√≥ con entusiasmo la diferencia en los coeficientes de partici√≥n cloroformo-agua de los amino√°cidos acetilados, lo cual presentaba perspectivas promisorias para la extracci√≥n l√≠quido-l√≠quido,y para esto fue contactado con Martin, de gran experiencia en la distribuci√≥n en contracorriente que hab√≠a desarrollado un aparato que lo hab√≠a hecho conocido en Cambridge. Poco tiempo despu√©s se encontraron trabajando en la Wool Research Association en Leeds, UK, donde debieron crear otro aparato porque el que ten√≠an no era compatible con el sistema agua-cloroformo. El nuevo aparato de flujo continuo ten√≠a 39 "platos te√≥ricos" (la figura 1.10 representa un sistema ideado por Lyman Craig en los '40 (18) no necesariamente id√©ntico al sistema de Martin, pero que muestra un tren de extracci√≥n en contracorriente utilizado en aquellos a√Īos).

cromatografia
cromatografia

Figura 1.10. Tren de distribuci√≥n en contracorriente desarrollado por Lyman Craig en 1944, que simplificaba notablemente el proceso de extracci√≥n m√ļltiple en ampollas de decantaci√≥n. Publicado con autorizaci√≥n de American Chemical Society(18).

Seg√ļn se indicaba, era un sistema complicado, que deb√≠a ser atendido por dos operadores en ciclos de 4 horas, adormecidos por los vapores de cloroformo. Los resultados no fueron demasiado satisfactorios, y Martin y Synge trataron de mejorar el sistema creando variantes. Un sistema intermedio era un tubo de vidrio con las fibras de lana y algod√≥n orientadas en el sentido del tubo, con el cloroformo movi√©ndose en un sentido y el agua en el opuesto. Tampoco funcion√≥ como se esperaba hasta que finalmente Martin pens√≥ que no era necesario mover los dos l√≠quidos, que pod√≠a dejarse uno estacionario en una columna y mover el otro.

Para lograr este propósito impregnaron con agua la silicagel que usaban como desecante en la balanza y con este material empacaron una columna de vidrio, agregaron la mezcla de aminoácidos acetilados y vertieron cloroformo en la entrada, tal vez como en el esquema de la figura 1.11). El agregado de naranja de metilo les permitía seguir la trayectoria de los aminoácidos a través de la columna. Hoy puede sonar muy simple, pero sin duda fue un arduo trabajo preparar apropiadamente la fase estacionaria (agua) sobre un soporte que no se había fabricado para eso (silicagel) y preparar apropiadamente la fase móvil (cloroformo) en forma reproducible. Martin desarrollo en paralelo la teoría de la cromatografía basada en conceptos de destilación, y el trabajo fue enviado en dos partes en noviembre de 1941 al Biochemical Journal, y publicado en diciembre de 1941 como Una nueva forma de cromatografía empleando dos fases liquidas (19-20) En base a este trabajo Martin y Synge recibieron en 1952 el Premio Nobel de Química por la Invención de la Cromatografía de Partición.


Figura 1.11. Esquema de la co-lumna de cromatografía de par-tición o LLC. La partícula solida se comporta como un soporte inerte,y la fase estacionaria es el líquido que la embebe,y que es inmiscible con la fase móvil, y con el solvente de la muestra.

Poco tiempo después Synge se apartó del grupo para investigar aminoácidos en antibióticos, y fue el primero en elucidar la secuencia en un polipéptido usando cromatografía en papel.

Por su parte Martin se unió en 1948 al Medical Research Council y se ocupó del análisis de ácidos grasos por cromatografía. Como su sistema tenía una fase estacionaria polar y una fase móvil poco polar (agua y cloroformo), los coeficientes de partición no lo favorecían, de modo que decidió desarrollar una fase estacionaria hidrofóbica para retener los ácidos grasos. Lo consiguió junto a Howard (20), tratando kieselguhr (tierra de diatomeas) con Dimetil diclorosilano (ver figura 1.12).

A diferencia de la cromatografía de partición líquido-líquido desarrollada en el '41 donde la fijación del líquido a la fase estacionaria era una simple retención mecánica en los poros y por lo tanto inestable, esta reacción unía la molécula silanizante con el soporte por unión covalente, dejando el líquido no polar (el dimetilsilano) como la fase estacionaria hidrofóbica, inmiscible con el solvente polar de la fase móvil. Martin usó este sistema para separar ácido láurico de esteárico por partición.


Figura 1.12. Reacción de silanizacion con la que Martin y Howard consiguieron unir covalentemente un líquido, Dimetil diclorosilano al soporte inerte de LLC, kieselguhr o tierra de diatomeas.

Por otra parte, Martin había predicho el uso de una fase móvil gaseosa en 1941, pero no desarrolló la idea hasta 1950 cuando llevó la fase estacionaria silanizada a la GC, publicando el método como cromatografía de partición gas-líquido en octubre de 1950. Este método demostró su utilidad en poco tiempo y fue base del desarrollo de la cromatografía gas-líquido (GLC).

En poco tiempo este material volvió a migrar a cromatografía liquida y fue usada por primera vez en 1967 por Aue y Hasting en la Universidad Dalhouise en Nova Scotia, pero probablemente el primer material de relleno comercializado y usando fase reversa fue el desarrollado en 1972 por Kirkland en Dupont. Este material se llamó Permaphase ODS, era de tipo pelicular y estaba constituido por microesferas de 35 um de diámetro con una fina capa estacionaria de silicagel unida a octadecilsilano, totalizando una partícula esférica de unos 50 um de diámetro. Antes de esto, en 1966-1967 Csaba Horvath notó que lapresión de trabajo necesaria era mayor de 1000 psi, y pensando que esta tecnología merecía un nuevo nombre fue el primero en usar las cuatro letras que hoy conocemos, HPLC(21).

En 1972, Majors desarrollo en Varian el material microparticular de 10 őľm de silicagel unida a ODS. Este material se llam√≥ MicroPak-CH. Muy poco tiempo despu√©s, en 1973 Csaba Horvath bautiza el m√©todo como Fase Reversa.

Retrospectivamente, hoy puede llamar la atenci√≥n la relativamente escasa difusi√≥n que logro la cromatograf√≠a de partici√≥n liquido-liquido, aunque podemos ver que causas importantes para esto fueron debidas a la calidad del soporte, todav√≠a no dise√Īado para estos prop√≥sitos, la dificultad en mantener estable la fase estacionaria en el soporte s√≥lido y la preparaci√≥n de la fase m√≥vil. Probablemente por esta causa IUPAC ha publicado en 1972 un art√≠culo indicando que "la fase reversa es solo una t√©cnica de inter√©s hist√≥rico".Sin embargo, la uni√≥n covalente de un l√≠quido al solido de soporte fue otro hecho fundamental que llevo al desarrollo de modernas fases estacionarias, de caracter√≠sticas f√≠sicas de un s√≥lido, pero conteniendo un l√≠quido de interfase con uni√≥n estable.

Podemos decir que a comienzos de la d√©cada del '70 nace la HPLC, con el desarrollo de columnas rellenas con macropart√≠culas eficientes y sistemas que permit√≠an la eluci√≥n de la fase m√≥vil por empleo de bombas y alta presi√≥n. Como se indica m√°s arriba, las primeras part√≠culas utilizadas eran de tipo pelicular, consistentes en peque√Īas esferas de vidrio de unos 35 őľm recubiertas de una fina capa de silicagel unida covalentemente a octadecilsilano (ODS o C18), resultando en una part√≠cula de unos 50 őľm.

Poco tiempo despu√©s se desarrollaron macropart√≠culas totalmente porosas de 10 őľm de di√°metro, y se fue diversificando la oferta de fases estacionarias de diferente funcionalidad, pero esto ya ser√° desarrollado con mayor detalle en los cap√≠tulos siguientes.

Referencias

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