Chromatographie

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Grundlagen der FlĂŒssigchromatographie

Definition und primÀre Klassifizierung der Chromatographie

Laut IUPAC (1-4) können wir das Verfahren definieren als "ein physikalisches Trennverfahren, bei dem die Bestandteile der zu trennenden Probe auf zwei Phasen verteilt werden, von denen eine stationÀr bleibt (stationÀre Phase), wÀhrend sich die andere (die mobile Phase) in einer bestimmten Richtung bewegt.

Die stationĂ€re Phase ist eine der beiden Phasen, aus denen das chromatographische System besteht. Sie kann ein Feststoff, ein Gel oder eine FlĂŒssigkeit sein. Wenn es sich um eine FlĂŒssigkeit handelt, kann sie ĂŒber einen Feststoff verteilt werden...

Die mobile Phase ist eine FlĂŒssigkeit, die in einer bestimmten Richtung durch oder entlang eines stationĂ€ren Bettes perkoliert. Sie kann eine FlĂŒssigkeit (FlĂŒssigkeitschromatographie) oder ein Gas (Gaschromatographie) sein..

Nach der IUPAC kann die Chromatographie auf verschiedene Weise klassifiziert werden, und zwar nach der Methode, der Form des stationÀren Bettes, der physikalischen Beschaffenheit der mobilen Phase und nach der Art der Trennung (siehe Abbildung 1.1.).

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Figure 1.1. Classification of chromatography according to method, physical form of the stationary bed and physical state of the mobile phase according to IUPAC(1).

In relation to liquid chromatography (LC) on column, we can find LC with large particles operated by gravity or at low pressure, known as liquid chromatography on column, and LC with microparticles that require the use of pumps for the elution of the mobile phase. If the microparticles are larger than 2 ÎŒm it is possible to use an HPLC system, but if they are less than 2 ÎŒm it is necessary to use a UPLC or UHPLC system.

Die Klassifizierung nach dem Trennungsmechanismus ist etwas umfangreicher und komplexer und umfasst die folgenden(1).

Method DesignationSeparation mechanism
Adsorptions-ChromatographieUnterschied in der AdsorptionsaffinitÀt zwischen Probenbestandteilen und den aktiven Stellen der stationÀren Phase.
aktive Stellen der stationÀren Phase
AffinitÀts-ChromatographieBiologische SpezifitÀt der Analyt-Ligand-Interaktion
Gegenstrom-Chromatographie(CCC)Teilung zwischen zwei nicht mischbaren flĂŒssigen Phasen ohne festen TrĂ€ger
Chirale oder enantioselektive ChromatographieTrennung durch Wechselwirkung mit einem chiralen Partner im System, typischerweise die stationÀre Phase, kann aber auch in der mobilen Phase sein.
GrĂ¶ĂŸenausschlusschromatographie (SEC)Trennung durch Ausschluss (GrĂ¶ĂŸe und/oder Form des Analyten) mit Kalibrierungskurven auf der Grundlage des Molekulargewichts. Je nach mobiler Phase kann es sich um GFC (wĂ€ssrig) oder GPC (organisch) handeln.
Hydrodynamische ChromatographieTrennung von MakromolekĂŒlen durch den Geschwindigkeitsunterschied der mobilen Phase zwischen der Achse und der Achse und den WĂ€nden der SĂ€ule
Interaction Chromatography Hydrophilic-HILICTrennungs-/Ionenaustausch in einer NormalphasensÀule unter Verwendung einer organischen mobilen Phase mit einem geringen Anteil an Wasser. mit einem geringen Anteil an Wasser
Wechselwirkungschromatographie Hydrophob-HICTrennung durch Wechselwirkung zwischen hydrophoben Stellen der stationÀren Phase und hydrophoben Bereichen der Proteine, die durch die Wirkung der IonenstÀrke freigelegt werden
IonenaustauschchromatographieTrennung durch Ionenaustausch zwischen funktionellen Gruppen der SĂ€ule und Probenbestandteilen. Der Austausch kann von Anionen oder Kationen erfolgen.
IonenausschlusschromatographiePartikelausschluss und frĂŒhzeitige Elution von ionischen Komponenten, wĂ€hrend entgegengesetzt geladene Verbindungen zurĂŒckgehalten und anschließend eluiert werden
Ionen-PaarungschromatographieAufteilung der Ionenpaare, die sich zwischen dem ionischen Analyten und einem Zusatzstoff mit entgegengesetzter Ladung in einem geeigneten Puffer bilden. entgegengesetzte Ladung, in einem geeigneten Puffer
LigandenaustauschchromatographieTrennung auf der Grundlage der FĂ€higkeit des Analyten, mit Metallen Komplexe zu bilden
Mizellare ChromatographieUmkehrphasenchromatographie, bei der die mobile Phase ein Tensid in einer Konzentration enthÀlt, die höher ist als die kritische Mizellenkonzentration
Normalphasen-ChromatographieTrennung, bei der die stationÀre Phase stÀrker polar ist als die mobile Phase
Trennungs-ChromatographieTrennung aufgrund der unterschiedlichen Löslichkeit der Probenbestandteile zwischen der mobilen und der stationÀren Phase. zwischen der mobilen Phase und der stationÀren Phase
Umkehrphasen-ChromatographieLC-Trennung, bei der die mobile Phase stÀrker polar ist als die stationÀre Phase

HPLC - UPLC - UHPLC

HPLC stands for High Performance Liquid Chromatography, which will be translated here as High Performance Liquid Chromatography, keeping that acronym. Diese Bezeichnung wird anderen, in anderen Medien verwendeten Bezeichnungen wie CLAP, High Performance oder High Efficiency vorgezogen, die auch von anderen Quellen verwendet werden. Sie wird auch nicht als Hochdruck-FlĂŒssigkeitschromatographie ĂŒbersetzt, in Anlehnung an das erstmals von Csaba Horvath, dem Pionier dieser Wissenschaft, verwendete Akronym, und zwar aus dem einfachen Grund, dass Druck kein Trennwerkzeug ist, sondern die natĂŒrliche Folge des erzwungenen Durchgangs einer FlĂŒssigkeit durch eine mit Makropartikeln gefĂŒllte SĂ€ule. Eine klarere Tatsache, die jedoch zu einigen MissverstĂ€ndnissen gefĂŒhrt hat, ist das Aufkommen der UHPLC. Da "herkömmliche" HPLC-Systeme mittlerweile DrĂŒcke bis zu 6000 psi erzeugen können, wurde dieser Druck zum Industriestandard. Die Entwicklung der Partikelchromatographie zu Durchmessern von weniger als 2 ÎŒm machte es jedoch erforderlich, diese Barriere zu ĂŒberwinden. Der erste, der dies tat, war die Waters Corp., die das UPLCÂź-System "Ultra Performance Liquid Chromatography" nannte und den Namen und das Akronym markenrechtlich schĂŒtzen ließ, wodurch die Verwendung dieses Akronyms durch andere GerĂ€tehersteller verhindert wurde.

Diese Systeme können heute DrĂŒcke von bis zu 1500 atm oder fast 22000 psi erreichen, und es ist klar, dass das Ziel ihrer Entwicklung einfach darin bestand, die geschaffenen Sub-2-Partikel zu nutzen, wofĂŒr es notwendig war, den maximalen Arbeitsdruck zu erhöhen und das Totvolumen des Systems so weit wie möglich zu verringern, das Zellenvolumen zu reduzieren und die Ansprechgeschwindigkeit des Detektors zu erhöhen, wesentliche Faktoren, um die mit der Verringerung der PartikelgrĂ¶ĂŸe gewonnene Effizienz nicht zu verlieren.

Da es gelang, bei höherem Druck mit Partikeln kleineren Durchmessers und damit effizienter zu arbeiten, wurde diese Methode offenbar als besser und damit anders als die HPLC angesehen, die einen anderen Namen verdiente. Angesichts der Neuheit lehnte die kommerziell benachteiligte Konkurrenz dieses Verfahren zunĂ€chst mit dem Argument ab, dass es sich nicht lohne, bei so hohem Druck zu arbeiten, was die Vorstellung verstĂ€rkte, dass es sich um ein anderes System handele. Mit zunehmender Verbreitung der Methode und angesichts der höheren Arbeitsgeschwindigkeit, der grĂ¶ĂŸeren Effizienz und des geringeren Lösungsmittelverbrauchs begannen schließlich die Entwicklung und die allgemeine Produktion dieser GerĂ€te, die als UHPLC bezeichnet wurden, um die Verwendung eines bereits eingetragenen Namens zu vermeiden.

Die Folge war, dass es in regulierten Bereichen, z. B. USP, EP, JP, nicht möglich war, Verfahren, die in der HPLC entwickelt und validiert wurden, auf die UHPLC zu ĂŒbertragen, einfach weil es sich um eine andere Trennmethode handeln wĂŒrde. Die SĂ€ulen, FĂŒllstoffe und die FunktionalitĂ€t der FĂŒllstoffe sind jedoch die gleichen, die mobile Phase ist die gleiche, die Trennmechanismen, die Interpretation der Chromatogramme und die Berechnungen sind die gleichen. Es musste abgewartet werden, bis das System ausgereift war und die Gleichwertigkeit experimentell nachgewiesen werden konnte, um eine Übertragung der Verfahren zu ermöglichen, was 2017 zum ersten harmonisierten Dokument des Chromatographie-Kapitels der USP (5), EP und JP fĂŒhrte, in dem die Übertragung von Methoden von der HPLC auf die UHPLC und umgekehrt in regulierten Umgebungen vorgeschlagen wurde. Dies Ă€ndert natĂŒrlich nichts daran, dass offizielle Methoden vor der Anwendung verifiziert werden sollten, wie von USP (6), FDA (7), ISO(8) und AOAC (9) vorgeschrieben, unabhĂ€ngig davon, ob sie auf UHPLC ĂŒbertragen wurden oder nicht. Das wichtigste Konzept ist die Schlussfolgerung, dass beide ModalitĂ€ten gleichwertig sind und dass offizielle Verfahren ohne Verlust des "offiziellen" Status aufgestockt, verifiziert und wie ursprĂŒnglich validiert verwendet werden können.

Der Mechanismus der Trennung

Um auf die IUPAC-Definition zurĂŒckzukommen: "Die Chromatographie ist ein physikalisches Trennverfahren, bei dem die Bestandteile der zu trennenden Probe in zwei Phasen verteilt sind...".

Wir mĂŒssen also ein Drei-Komponenten-System bewerten: die Probe, die stationĂ€re Phase und die mobile Phase. In Abbildung 1.2 besteht die Probe aus drei Komponenten, von denen jede eine andere chemische Struktur hat, die durch das Vorhandensein von funktionellen Gruppen gekennzeichnet ist, die sie identifizieren, z. B. phenolische oder alkoholische Hydroxylgruppen, primĂ€re oder sekundĂ€re Amine, Aldehyde, Ketone usw. Die mobile Phase und die stationĂ€re Phase haben wiederum ihre eigenen funktionellen Gruppen, die ihnen eine AffinitĂ€t fĂŒr komplementĂ€re funktionelle Gruppen verleihen (siehe Abbildung 1.1).

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Abbildung 1.2. Probenbestandteile und ihre Wechselwirkung mit dem System, der mobilen Phase und der stationĂ€ren Phase. Die chemische FunktionalitĂ€t jedes Bestandteils bestimmt seine AffinitĂ€t zu diesen Komponenten und damit seine grĂ¶ĂŸere oder geringere Retention in der SĂ€ule. Drei Arten von MolekĂŒlen sind schematisch dargestellt: ein linearer Kohlenwasserstoff, ein dipolares MolekĂŒl und ein Phenol als polares MolekĂŒl.

Es gibt mehrere Wechselwirkungen, die die AffinitĂ€t zwischen MolekĂŒlen modellieren. Eine der wichtigsten ist die WasserstoffbrĂŒcke, bei der ein Wasserstoffatom kovalent an ein elektronegatives Atom in einem protonenabgebenden MolekĂŒl gebunden ist, das es freilegt. In der Umgebung kann es ein ProtonenakzeptormolekĂŒl mit einem anderen elektronegativen Atom finden, das sich nach dem Proton sehnt, das es anzieht, es aber nicht nehmen kann, weil es kovalent an das erste MolekĂŒl gebunden ist. Diese Wechselwirkung ist in der Natur weit verbreitet, z. B. zwischen Carbonyl- und Aminogruppen in Proteinen zur Bildung ihrer dreidimensionalen Struktur, zwischen komplementĂ€ren Basen der DNA, zwischen Wasser und dem Hydroxyl eines Alkohols oder einem Carbonyl usw.

Zu den weiteren Wechselwirkungen gehören elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Anionen und Kationen, hydrophobe und hydrophile Wechselwirkungen, die die Vermischung von Öl und Wasser, die zusammenklumpen, erschweren, sterische Wechselwirkungen, die es einem MolekĂŒl erschweren, in die gebundene Phase einzutreten, und zwar aufgrund sterischer Hindernisse, die einfach auf die GrĂ¶ĂŸe des Analyten zurĂŒckzufĂŒhren sind, die schwachen Londoner KrĂ€fte, die durch die vorĂŒbergehenden Dipole entstehen, die in jedem Atom durch die Bewegung seiner Elektronen erzeugt werden, die Dipol-Wechselwirkungen, die durch MolekĂŒle mit permanenter PolaritĂ€t wie Acetonitril entstehen, sowie andere RetentionskrĂ€fte (Abbildung 1.3)..

Bei der chromatographischen Trennung (Abbildung 1.4) wird die in einer SĂ€ule enthaltene stationĂ€re Phase mit einem konstanten Strom mobiler Phase Ă€quilibriert. Der SĂ€ulenausgang ist mit einem ÜberwachungsgerĂ€t verbunden, das eine physikalisch-chemische Eigenschaft der eluierenden FlĂŒssigkeit misst, im Falle der Abbildung ein photometrischer oder spektrophotometrischer Detektor, es kann sich aber auch um einen LeitfĂ€higkeits-, Fluoreszenz- oder amperometrischen Detektor usw. handeln.

Sobald das System im Gleichgewicht ist, wird die Probe injiziert, die aus einer Lösung mit verschiedenen Komponenten besteht, die durch die SĂ€ule transportiert werden. Je nach chemischer FunktionalitĂ€t weist jede der Komponenten eine höhere AffinitĂ€t fĂŒr die mobile Phase auf und eluiert schneller, oder eine höhere AffinitĂ€t fĂŒr die stationĂ€re Phase und wird entsprechend dieser Wechselwirkung zurĂŒckgehalten.

Infolgedessen durchlaufen die Komponenten die SĂ€ule mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und werden getrennt. Die eluierte mobile Phase durchlĂ€uft eine Durchflusszelle, wo sie von dem entsprechenden System ĂŒberwacht wird, in diesem Fall von einem Lichtstrahl, der durch die Durchflusszelle zu einer Fotozelle geleitet wird, die auf die VerĂ€nderung der LichtdurchlĂ€ssigkeit/Absorption reagiert. Die mobile Phase setzt ihren Weg fort, und das Signal der Fotozelle, das proportional zur momentanen Absorption des Eluats ist, das die Zelle durchlĂ€uft, wird an einen Schreiber oder an ein Datenaufzeichnungs- und -verarbeitungssystem auf einem Computer ĂŒbertragen. Das Ergebnis ist ein Chromatogramm, eine Darstellung des von der Fotozelle erzeugten Signals als Funktion der Zeit (siehe Abbildungen 1.7 a und b).

Das Chromatogramm zeigt dann die Trennung der Komponenten der eingespritzten Lösung in einem Diagramm des vom Detektor erfassten Signals (mV) als Funktion der Zeit (Minuten). Die Retentionszeit (als Peak-Apex-Elutionszeit) ist eine Folge der chemischen Struktur und der FunktionalitÀt und daher eine primÀre Funktion der IdentitÀt der Komponente. Die Retentionszeit von A identifiziert in erster Linie die Verbindung A als Bestandteil der eingespritzten Lösung, ebenso wie B und C. Die IntensitÀt des Signals, gemessen als Peakhöhe oder FlÀche unter der Kurve, ist eine primÀre Funktion der Konzentration.

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Abbildung 1.3: Einige Beispiele fĂŒr die Wechselwirkung zwischen Analyt, mobiler Phase und stationĂ€rer Phase: transiente Londoner Dipole, permanente Dipolwechselwirkung, sterische Effekte, hydrophobe und hydrophile Wechselwirkung und WasserstoffbrĂŒckenbildung.
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Abbildung 1.4. Schematische Darstellung der chromatographischen Trennung und ihres Ergebnisses, des Chromatogramms. Die auf der SĂ€ule abgetrennten Verbindungen werden am Ausgang mit Hilfe eines Detektors ĂŒberwacht, in diesem Fall eines photometrischen Detektors, der das Signal, in diesem Fall die Absorption, als Funktion der Zeit aufzeichnet. Das Elutionsvolumen/die Retentionszeit ist eine primĂ€re Funktion der IdentitĂ€t des Analyten, da sie von seiner chemischen FunktionalitĂ€t abhĂ€ngt. Die IntensitĂ€t des Signals, die durch die Peakhöhe oder die FlĂ€che unter der Kurve dargestellt wird, ist eine Funktion der Konzentration jedes von der SĂ€ule eluierten Analyten.

Da es nicht möglich ist, die Retentionszeit oder das Ansprechverhalten des gelösten Stoffes a priori zu kennen, ist es notwendig, einen geeigneten Referenzstandard des Materials zu haben. Zu diesem Zweck wird eine Lösung mit bekannter Konzentration des Standards eingespritzt, und das System wird kalibriert, um die IdentitĂ€t der Komponente auf der Grundlage ihrer Retentionszeit zuzuordnen, und es wird ein Reaktionsfaktor berechnet, der die IntensitĂ€t des Signals mit der Konzentration des Standards in Beziehung setzt. Wenn dann die Probe eingespritzt wird, wird die (mit dem Standard identische) Zielkomponente anhand der Retentionszeit und ihre Konzentration anhand des fĂŒr den Standard geschĂ€tzten Reaktionsfaktors identifiziert.

An dieser Stelle sollte das UnschĂ€rfeprinzip in Bezug auf die IdentitĂ€t erwĂ€hnt werden. Es ist zwar klar, dass die IdentitĂ€t der Komponenten A, B und C von der Retentionszeit abhĂ€ngt, aber es ist auch klar, dass es in der Natur sicherlich Dutzende oder Hunderte von Verbindungen gibt, die mit einer Retentionszeit eluieren, die der Retentionszeit der Zielkomponente Ă€hnelt oder nicht von ihr zu unterscheiden ist. Im Falle der Abbildung kann es Hunderte von Verbindungen geben, die in einem 10-minĂŒtigen Lauf eluieren. Die erste Behauptung, die IdentitĂ€t, ist also zuverlĂ€ssiger, wenn die VariabilitĂ€t der Komponenten nicht sehr groß ist, z. B. in einer Industrie, die einige Dutzend Materialien zur Herstellung einiger weniger Produkte verarbeitet. Mit zunehmender Vielfalt wird ein Bedarf an Instrumenten zur IdentitĂ€tsbestĂ€tigung bestehen, z. B. durch Strukturanalyse (gleichzeitige spektroskopische Analyse, Analyse der Peak-Reinheit, Molekulargewicht), um die GĂŒltigkeit des Ergebnisses zu kontrollieren. Und es wird FĂ€lle geben, in denen die Vielfalt absolut komplex ist, wie bei bioanalytischen Tests, bei denen die biologischen Matrizes eine sehr hohe Anzahl potenzieller Störfaktoren aufweisen, oder bei einem Umweltscreening oder bei der Analyse einer bestimmten Struktur in natĂŒrlich komplexen Matrizes wie FrĂŒchten oder Pflanzenextrakten. In diesen FĂ€llen kann es absolut notwendig sein, sehr selektive Detektoren zu haben, wie z. B. Masse-Masse- oder Flugzeit-Kopplungen.

In Bezug auf die konzentrationsbezogene Unsicherheit ist es klar, dass eine Korrelation zwischen der Reaktion und der Konzentration des Standards im verwendeten System gesucht werden muss und dass die Reaktion des Analyten auf dieser Kalibrierkurve in einem qualifizierten System unter Verwendung eines validierten Verfahrens interpoliert werden muss.

Das chromatographische System

Abbildung 1.5 zeigt schematisch die einfachste Version eines HPLC-Systems. Erforderlich sind mindestens ein Reservoir fĂŒr die mobile Phase, eine Pumpe, ein Injektor, eine SĂ€ule und ein Detektor mit den dazugehörigen SchlĂ€uchen und Verbindungen. Der Detektor sollte mindestens an einen XY-Schreiber angeschlossen sein, obwohl die moderne Analytik die Verwendung eines Computers als Datenerfassungs-, -speicherungs- und -verarbeitungssystem empfiehlt.

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Abbildung 1.5. Grundschema eines Chromatographen. Die wichtigsten Bestandteile sind das Reservoir fĂŒr die mobile Phase, die Pumpe, der Injektor, die SĂ€ule, der Detektor und ein AbfallgefĂ€ĂŸ, die alle durch Rohrleitungen mit entsprechendem Innendurchmesser verbunden sind. Das elektrische Signal als Funktion der Zeit wird von einem GerĂ€t aufgezeichnet, das von einem Diagrammschreiber bis zu einem Computer reichen kann, wobei im letzteren Fall zusĂ€tzlich die Möglichkeit besteht, das Signal fĂŒr die Wiederaufbereitung oder die behördliche Kontrolle zu speichern.

Obwohl dieses Grundschema fĂŒr eine Vielzahl von Anwendungen ausreichend sein mag, ist seine Ausweitung auf komplexere Systeme aufgrund des Optimierungs- und Automatisierungsbedarfs unvermeidlich (siehe Abbildung 1.6). So hĂ€ngt beispielsweise die ZuverlĂ€ssigkeit der instrumentellen Analyse in hohem Maße von der statistischen Analyse ab, die die Verarbeitung von Wiederholungen zur Berechnung der Unsicherheit fördert, was dazu fĂŒhrt, dass automatische Injektoren erwĂŒnscht sind, die ihrerseits eine Optimierung von Zeit und Ressourcen ermöglichen.

Dann ist es manchmal notwendig, Elutionsgradienten zu verwenden, was die Verwendung mehrerer Lösungsmittel zur Vorbereitung der mobilen Phase in situ ermöglicht, die durch Online-Entgaser laufen, bevor sie die Pumpe erreichen. Der Gradient kann mit einer oder zwei Pumpen gebildet werden.

Es ist dann möglich und manchmal auch praktisch, einen SÀulenofen zu verwenden, um eine oder mehrere ChromatographiesÀulen aufzunehmen. Das System kann so programmiert werden, dass die erste SÀule verwendet, gewaschen und konditioniert wird, die zweite SÀule verwendet und gewaschen wird und das System nach Beendigung abgeschaltet wird, ohne dass ein Analytiker tÀtig werden muss. Die Vielfalt der Analyten kann die Verwendung von mehr als einem Detektor erforderlich machen, und das SÀuleneluat muss nicht unbedingt verworfen werden, sondern die einzelnen Komponenten können mit geeigneten Systemen gesammelt werden.

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Abbildung 1.6. Das Grundschema in Abbildung 1.5 erhöht die KomplexitĂ€t bei Entwicklungs- und Routinearbeiten, vor allem um die Vorteile der Automatisierung besser nutzen zu können. Es ist ĂŒblich, die mobile Phase vom System vorbereiten zu lassen, anstatt dies am PrĂŒfstand zu tun. Dies erfordert die gleichzeitige Verwendung von mehr als einem Lösungsmittel, das auch in situ entgast werden kann. Es ist auch nicht unĂŒblich, mehr als eine SĂ€ule oder mehr als einen Detektor zu verwenden. Oder man trennt die Fraktionen im prĂ€parativen Modus, anstatt die getrennten Fraktionen zu verwerfen. Auch das Waschen der SĂ€ulen vor dem Wechsel auf die nĂ€chste SĂ€ule erfolgt automatisch.
ChromatogramSystem suitability test 
MaterialStandard solution 1018Source: QA Laboratory
AnalystFQ-SRVial: 1
Date:07/26/2022Time: 12:19:46
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Abbildung 1.7 a. Typischer Chromatographiebericht mit einer Tabelle fĂŒr die injizierte Probe. Das typische Chromatogramm zeigt die Informationen zur verarbeiteten Probe (Herkunft, Analytiker, Datum, Uhrzeit, FlĂ€schchen usw.), das Chromatogramm mit den Banden und ihrer Identifizierung und schließlich eine Tabelle mit der Liste der Peaks in der Reihenfolge ihres Auftretens, ihrer IdentitĂ€t gemĂ€ĂŸ einem frĂŒheren Kalibrierungsstandard und fĂŒr jeden Peak seine Retentionszeit, FlĂ€che unter der Kurve, Höhe und einige informative QualitĂ€tsdaten (Effizienz, Asymmetrie und Auflösung).
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Abbildung 1.7 b. Typische Visualisierung des Chromatogramms in der Verarbeitungssoftware, in diesem Fall EmpowerÂź Waters Corp, wo die Graphen angezeigt werden: oben links das Isogramm (2D-Projektion des 3D-Diagramms: Zeit vs. Reaktion vs. WellenlĂ€nge - siehe Kapitel 3 - auf einem PDA oder DAD), unten links das Chromatogramm bei der im Isogramm angegebenen WellenlĂ€nge (246 nm) und rechts die UV-Absorptionsspektren der identifizierten Peaks. Diese Spektren können in die Bibliothek ĂŒbernommen und zur Peakidentifizierung verwendet werden.
Kurze Geschichte der FlĂŒssigchromatographie

Im Folgenden wird die geschichtliche Entwicklung der FlĂŒssigchromatographie und der HPLC anhand von Artikeln namhafter Chromatographieforscher skizziert. Es ist nicht beabsichtigt, eine erschöpfende oder vollstĂ€ndige Beschreibung der Entwicklung der Chromatographie zu geben und ist sicherlich unfair gegenĂŒber vielen Forschern, deren Beitrag grundlegend fĂŒr diese wesentliche Technik in praktisch allen modernen Wissenschaften war, aber die LektĂŒre kann helfen, die Mechanismen zu verstehen und vielleicht die aktuellen Verfahren zu verbessern. Viele der zitierten Ereignisse mögen kurz den Ursprung und einige Meilensteine aufzeigen, die es uns ermöglicht haben, hierher zu gelangen(11-17).

Am Anfang steht die Erfindung der Chromatographie, die wir Mikhail Semyonovich Tsweet verdanken, der sie im Jahr 1900 entwickelte. Zweet wurde 1872 in Asti, Italien, als Sohn einer italienischen Mutter und eines russischen Offiziers geboren. In jungen Jahren zog er in die Schweiz, wo er ein Studium der Botanik aufnahm. Er folgte seinem Vater, als dieser nach Russland zurĂŒckgerufen wurde, und ließ sich in St. Petersburg nieder. Er musste seine AbschlĂŒsse in Moskau, wo er akademische TĂ€tigkeiten ausĂŒbte, sowie in Warschau und Litauen revalidieren. Die Bezeichnung Chromatographie verwendete er erstmals 1906 in seinen Veröffentlichungen (siehe Abbildung 1.8). Bei seinen Arbeiten fĂŒllte er Glasröhren mit einem Feststoff, im Falle der Abbildung mit Kalziumkarbonat, und brachte sie mit einer FlĂŒssigkeit, Schwefelkohlenstoff, ins Gleichgewicht. Nachdem er am oberen Ende Chlorophylle in Lösung eingebracht hatte, eluierte er die FlĂŒssigkeit durch die SĂ€ule, woraufhin sich die Pigmente in der SĂ€ule trennten und eine Reihe farbiger Banden zum Vorschein kamen. Damals schuf er den Namen Chromatographie, der sich aus dem griechischen chroma (Farbe) und grapho (Schrift) zusammensetzt, d. h. Schrift in Farbe.

chromatographie
chromatographychromatographie
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Abbildung 1.8. Zeichnungen des 1906 von Tsweet veröffentlichten Artikels. Er zeigt (a) einen Apparat mit fĂŒnf gleichzeitigen SĂ€ulen mit einem Quecksilbermanometer und einem Gummiball fĂŒr die Abgabe der mobilen Phase. Sie zeigt außerdem (b) eine TrichtersĂ€ule mit einem Durchmesser von 2-3 mm und einer LĂ€nge von 20-30 cm, die auf einem Kitasat montiert ist, und (c) eine chromatographische Trennung von Pigmenten unter Verwendung von Kohlenstoffcarbonat als stationĂ€rer Phase und Schwefelkohlenstoff als mobiler Phase.Reproduziert mit Genehmigung von LC-GC.

In Wirklichkeit wurden die Probenbestandteile nicht von der SĂ€ule eluiert, wie wir es heute tun, sondern bildeten ein Farbmuster innerhalb der SĂ€ule, das die Zusammensetzung der Chlorophylle darstellt. Die Methode hatte große Auswirkungen, aber natĂŒrlich auch große EinschrĂ€nkungen, da sie farblose Komponenten nicht sichtbar machen konnte und die Elution der Komponenten der SĂ€ule nicht zuließ.

Die DĂŒnnschichtchromatographie (TLC) bietet eine Lösung fĂŒr dieses Problem: Die TLC kann als offene SĂ€ulenchromatographie betrachtet werden, so dass durch den Zugriff auf das Material je nach Bedarf eine spezifische oder universelle Entwicklung durchgefĂŒhrt werden kann. Die Anwendung eines Ninhydrinsprays und die anschließende Erhitzung machen beispielsweise die farblosen AminosĂ€uren sichtbar, die sich blau fĂ€rben. JoddĂ€mpfe, denen die Trockenplatte nach dem Durchlauf ausgesetzt wird, fixieren organische Verbindungen mit Doppel- oder Dreifachbindungen und fĂ€rben sie rötlich-braun. Durch einfaches BesprĂŒhen mit SchwefelsĂ€ure und anschließendes Erhitzen im Ofen bei 100°℃ werden die organischen Verbindungen verkohlt, was als dunkle Flecken auf der weißen Platte sichtbar wird.

HPTLC von Kamillenöl, verschiedene Offenbarungen

UV 254 nm mit und ohne Filter

UV 366 nm Nachderivatisierung

Anisaldehyd Drifting Reflactance R+T Transm.

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Abbildung 1.9: DĂŒnnschichtchromatographie von Kamillenöl, die das Ergebnis der Verwendung verschiedener Entwickler fĂŒr die Visualisierung der getrennten Verbindungen zeigt.

Einer der ersten Wegbereiter dieser Technik war Edgar Lederer, und in jĂŒngerer Zeit wurde sie von Egon Stahl weiterentwickelt. Die Wirkung der TLC war unmittelbar, und aufgrund ihrer Einfachheit und geringen Kosten setzte sie sich schnell in der analytischen Chemie durch. WĂ€hrend sich die FlĂŒssig- und Gaschromatographie weiter verbreitete, entwickelte sich die TLC in Osteuropa weiter. Sie wird auch heute noch verwendet, wenngleich ihre Verbreitung durch den Vormarsch der HPLC stark zurĂŒckgegangen ist.

Kurz darauf erlebte die FlĂŒssigkeitschromatographie (LC) in den 1940er Jahren einen bedeutenden Durchbruch, als Archer J.P. Martin und Richard L.M. Synge die Partitionschromatographie oder FlĂŒssig-FlĂŒssig-Chromatographie (LLC) im Gegensatz zur damals vorherrschenden FlĂŒssig-Fest-Chromatographie (LSC) schufen, und diese Entwicklung war so einflussreich, dass sie 1952 den Nobelpreis fĂŒr Chemie dafĂŒr erhielten.

Martin forschte im Dunn Nutritional Laboratory an Vitamin E und experimentierte mit der Trennung heterogener Phasen von Carotinen. Zu diesem Zweck hatte er ein System aus 45 aneinandergereihten Röhren konstruiert, die als UmfĂŒllampullen dienten und durch 90 Ventile getrennt waren, die den RĂŒckfluss der FlĂŒssigkeit in die vorherige Ampulle verhinderten. Das Schema seiner Apparatur wurde nicht veröffentlicht.

Synge seinerseits untersuchte die AminosĂ€uren der Wolle im IWS, und die angewandte Methode bestand darin, die AminosĂ€uren zu acetylieren, um sie in Chloroform zu extrahieren. Er stellte mit Begeisterung den Unterschied in den Chloroform-Wasser-Verteilungskoeffizienten der acetylierten AminosĂ€uren fest, was vielversprechende Aussichten fĂŒr die FlĂŒssig-FlĂŒssig-Extraktion bot, und wurde dafĂŒr von Martin kontaktiert, der sehr erfahren in der Gegenstromverteilung war und eine Apparatur entwickelt hatte, die ihn in Cambridge bekannt gemacht hatte. Kurze Zeit spĂ€ter arbeiteten sie bei der Wool Research Association in Leeds, UK, wo sie eine weitere Apparatur entwickeln mussten, da die vorhandene nicht mit dem Wasser-Chloroform-System kompatibel war. Der neue Durchlaufapparat hatte 39 "theoretische Platten" (Abbildung 1.10 zeigt ein von Lyman Craig in den 40er Jahren entwickeltes System (18), das nicht unbedingt mit Martins System identisch ist, aber einen Gegenstromextraktionszug zeigt, der in jenen Jahren verwendet wurde).

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Abbildung 1.10. Von Lyman Craig 1944 entwickelter Gegenstromverteilungszug, der den Mehrfachextraktionsprozess in Dekantierampullen erheblich vereinfachte. Veröffentlicht mit Genehmigung der American Chemical Society(18).

 

Berichten zufolge handelte es sich um ein kompliziertes System, das von zwei Bedienern im 4-Stunden-Takt bedient werden musste, die durch ChloroformdĂ€mpfe in den Schlaf gewiegt wurden. Die Ergebnisse waren nicht sehr zufriedenstellend, und Martin und Synge versuchten, das System durch die Entwicklung von Varianten zu verbessern. Ein Zwischensystem war ein Glasrohr, bei dem die Wolle und die Baumwollfasern in Richtung des Rohrs ausgerichtet waren, wobei sich das Chloroform in eine Richtung und das Wasser in die entgegengesetzte Richtung bewegte. Beides funktionierte nicht wie erwartet, bis Martin schließlich auf die Idee kam, dass es nicht notwendig sei, die beiden FlĂŒssigkeiten zu bewegen, dass man eine in einer SĂ€ule stehen lassen und die andere bewegen könne.

Zu diesem Zweck imprĂ€gnierten sie das Kieselgel, das sie in der Waage als Trockenmittel verwendeten, mit Wasser und fĂŒllten mit diesem Material eine GlassĂ€ule, fĂŒgten das acetylierte AminosĂ€uregemisch hinzu und gossen Chloroform in den Einlass, etwa wie in der schematischen Darstellung in Abbildung 1.11). Durch die Zugabe von Methylorange konnten sie den Weg der AminosĂ€uren durch die SĂ€ule verfolgen. Das mag heute sehr einfach klingen, aber es war sicherlich harte Arbeit, die stationĂ€re Phase (Wasser) auf einem TrĂ€ger, der nicht fĂŒr diesen Zweck hergestellt worden war (Kieselgel), und die mobile Phase (Chloroform) in reproduzierbarer Weise richtig vorzubereiten. Martin entwickelte parallel dazu die Theorie der Chromatographie auf der Grundlage von Destillationskonzepten, und die Arbeit wurde in zwei Teilen im November 1941 dem Biochemical Journal vorgelegt und im Dezember 1941 als A New Form of Chromatography Employing Two Liquid Phases (19-20) veröffentlicht.

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Abbildung 1.11. Schematische Darstellung der Co-SĂ€ule der Partitionschromatographie oder LLC. Der Feststoffpartikel fungiert als inerter TrĂ€ger, und die stationĂ€re Phase ist die ihn aufsaugende FlĂŒssigkeit, die mit der mobilen Phase und dem Probenlösungsmittel nicht mischbar ist.

Kurz darauf verließ Synge die Gruppe, um AminosĂ€uren in Antibiotika zu untersuchen, und war der erste, der die Sequenz in einem Polypeptid mit Hilfe der Papierchromatographie aufklĂ€rte.

Martin trat 1948 dem Medical Research Council bei und beschĂ€ftigte sich mit der Analyse von FettsĂ€uren durch Chromatographie. Da sein System ĂŒber eine polare stationĂ€re Phase und eine wenig polare mobile Phase (Wasser und Chloroform) verfĂŒgte, waren die Verteilungskoeffizienten nicht gĂŒnstig, so dass er beschloss, eine hydrophobe stationĂ€re Phase zu entwickeln, um die FettsĂ€uren zurĂŒckzuhalten. Dies gelang ihm mit Howard (20) durch die Behandlung von Kieselgur mit Dimethyl-Dichlorsilan (siehe Abbildung 1.12).

Im Gegensatz zur '41 entwickelten FlĂŒssig-FlĂŒssig-Trennchromatographie, bei der die Bindung der FlĂŒssigkeit an die stationĂ€re Phase eine einfache mechanische Retention in den Poren war und daher instabil, band diese Reaktion das silanisierende MolekĂŒl durch kovalente Bindung an den TrĂ€ger, so dass die unpolare FlĂŒssigkeit (Dimethylsilan) als hydrophobe stationĂ€re Phase ĂŒbrig blieb, die mit dem polaren Lösungsmittel der mobilen Phase nicht mischbar war. Martin verwendete dieses System zur Trennung von LaurinsĂ€ure und StearinsĂ€ure durch Partitionierung.

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Abbildung 1.12. Silanisierungsreaktion, bei der es Martin und Howard gelang, eine FlĂŒssigkeit, Dimethyldichlorsilan, kovalent an den inerten LLC-TrĂ€ger, Kieselgur oder Kieselgur, zu binden.

Andererseits hatte Martin 1941 die Verwendung einer gasförmigen mobilen Phase vorausgesagt, entwickelte die Idee aber erst 1950 weiter, als er die silanisierte stationĂ€re Phase in die GC einfĂŒhrte und die Methode im Oktober 1950 als Gas-FlĂŒssigkeits-Verteilungschromatographie veröffentlichte. Diese Methode erwies sich in kurzer Zeit als nĂŒtzlich und bildete die Grundlage fĂŒr die Entwicklung der Gas-FlĂŒssig-Chromatographie (GLC).

Innerhalb kurzer Zeit wanderte dieses Material zurĂŒck in die FlĂŒssigchromatographie und wurde erstmals 1967 von Aue und Hasting an der Dalhouise University in Nova Scotia eingesetzt. Das wahrscheinlich erste kommerziell genutzte FĂŒllmaterial mit Umkehrphase wurde jedoch 1972 von Kirkland bei Dupont entwickelt. Dieses Material wurde Permaphase ODS genannt, war vom pellikulĂ€ren Typ und bestand aus MikrokĂŒgelchen mit einem Durchmesser von 35 um mit einer dĂŒnnen stationĂ€ren Schicht aus Kieselgel, die an Octadecylsilan gebunden war, so dass insgesamt ein kugelförmiges Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 50 um entstand. Zuvor, in den Jahren 1966-1967, stellte Csaba Horvath fest, dass der benötigte Arbeitsdruck mehr als 1000 psi betrug, und da er der Meinung war, dass diese Technologie einen neuen Namen verdiente, verwendete er als erster die vier Buchstaben, die wir heute kennen: HPLC(21).

1972 entwickelte Majors bei Varian das Mikropartikelmaterial aus 10 ÎŒm Kieselgel, das an ODS gebunden ist. Dieses Material wurde MicroPak-CH genannt. Kurz darauf, 1973, taufte Csaba Horvath die Methode auf den Namen Reverse Phase.

RĂŒckblickend mag die relativ geringe Verbreitung der FlĂŒssig-FlĂŒssig-Trennchromatographie heute auffallen, obwohl wir erkennen können, dass wichtige Ursachen dafĂŒr in der QualitĂ€t des TrĂ€gers, der noch nicht fĂŒr diese Zwecke ausgelegt war, in der Schwierigkeit, die stationĂ€re Phase auf dem festen TrĂ€ger stabil zu halten, und in der Zubereitung der mobilen Phase lagen. Wahrscheinlich aus diesem Grund veröffentlichte die IUPAC 1972 einen Artikel, in dem es hieß, dass "die umgekehrte Phase nur eine Technik von historischem Interesse ist"; die kovalente Bindung einer FlĂŒssigkeit an den TrĂ€gerfeststoff war jedoch eine weitere grundlegende Tatsache, die zur Entwicklung moderner stationĂ€rer Phasen fĂŒhrte, die die physikalischen Eigenschaften eines Feststoffs aufweisen, aber eine GrenzflĂ€chenflĂŒssigkeit mit stabiler Bindung enthalten.

Man kann sagen, dass in den frĂŒhen 1970er Jahren die HPLC geboren wurde, mit der Entwicklung von SĂ€ulen, die mit effizienten Makropartikeln gefĂŒllt waren, und Systemen, die die Elution der mobilen Phase durch den Einsatz von Pumpen und hohem Druck ermöglichten. Wie bereits erwĂ€hnt, waren die ersten verwendeten Partikel vom pellikulĂ€ren Typ, bestehend aus kleinen Glaskugeln von etwa 35 ÎŒm, die mit einer dĂŒnnen Schicht Kieselgel ĂŒberzogen waren, das kovalent an Octadecylsilan (ODS oder C18) gebunden war, was zu einem Partikel von etwa 50 ÎŒm fĂŒhrte.

Kurz darauf wurden vollstĂ€ndig poröse Makropartikel mit einem Durchmesser von 10 ÎŒm entwickelt, und das Angebot an stationĂ€ren Phasen mit unterschiedlicher FunktionalitĂ€t wurde diversifiziert, worauf jedoch auf den folgenden Seiten nĂ€her eingegangen wird.

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References

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